Поглощение и рассеяние света в биологических системах
Спектры поглощения биомолекул
Поглощение света биологическими структурами происходит в результате взаимодействия фотонов с электронами молекул. При этом важную роль играет энергетическая структура молекулы: свет может возбуждать переходы между различными электронными, вибрационными и вращательными уровнями. Особенно значимо поглощение в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Биомолекулы, содержащие хромофоры — например, порфириновые кольца, ароматические аминокислоты, нуклеиновые основания — обладают характерными спектрами поглощения.
У белков, например, наблюдается максимум поглощения при длине волны около 280 нм, обусловленный наличием остатков триптофана, тирозина и фенилаланина. Нуклеиновые кислоты интенсивно поглощают в области 260 нм. Такие спектры позволяют количественно определять концентрации молекул методом спектрофотометрии с использованием закона Бугера-Ламберта-Бера.
Рассеяние света и его биофизическое значение
Рассеяние возникает при неоднородностях показателя преломления в биосреде. В биологических системах оно наблюдается при взаимодействии света с клеточными структурами, органеллами, макромолекулами и даже флуктуирующими границами фаз. Рассеяние бывает двух типов: упругое (например, Рэлеевское и Ми-рассеяние) и неупругое (например, комбинационное или Раман-рассеяние).
Ми-рассеяние доминирует при взаимодействии с частицами, размеры которых сопоставимы с длиной волны света (например, клеточные ядра). Рэлеевское рассеяние характерно для структур существенно меньших по размерам, как, например, белковые агрегаты.
Флуоресценция и флуоресцентные зонды
Флуоресценция представляет собой процесс, при котором молекула, поглотив фотон, испускает фотон меньшей энергии спустя наносекундный интервал. В биофизике широко используются флуоресцентные зонды — соединения, изменяющие свою эмиссию в зависимости от свойств микроокружения (pH, полярность, ионная сила). Классическими примерами являются флуоресцеин, родамин, цианиновые красители.
Современные методы, такие как флуоресцентная спектроскопия времени жизни (FLIM), позволяют оценивать молекулярные взаимодействия, вязкость среды и динамику белков. Методика FRET (резонансный перенос энергии флуоресценции) позволяет измерять межмолекулярные расстояния в пределах 1–10 нм, что делает её исключительно ценной для изучения конформационных изменений и белок-белковых взаимодействий.
Двулучепреломление и оптическая активность
Некоторые биологические структуры, такие как мышечные волокна, митотическое веретено, коллагеновые волокна, обладают анизотропией показателя преломления, проявляющейся как двулучепреломление. Этот эффект используется в поляризационной микроскопии для визуализации ориентации макромолекул и субклеточных структур.
Оптическая активность, то есть способность вещества вращать плоскость поляризации света, обусловлена хиральностью биомолекул. Измерения угла вращения позволяют количественно оценивать концентрацию сахаров, аминокислот, белков и других оптически активных соединений.
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия
Конфокальная микроскопия позволяет получать высококонтрастные изображения тонких оптических сечений образца. Она основана на точечном освещении образца и детектировании флуоресценции через пространственную апертуру (пинхол), которая отсекает внефокусный свет. Таким образом достигается высокое разрешение по глубине и возможность трёхмерной реконструкции биологических объектов.
Использование конфокального микроскопа в сочетании с многоспектральными лазерами позволяет одновременно визуализировать несколько структур, окрашенных разными флуорофорами. Метод широко применяется для изучения морфологии клеток, распределения белков, динамики цитоскелета и процессов экзоцитоза/эндоцитоза.
Микроскопия сверхвысокого разрешения
Методы, преодолевающие дифракционный предел, такие как STED (стимулированная эмиссионная деплеция), PALM (микроскопия фотоактивацией), STORM (микроскопия стохастической реконструкцией), позволяют достичь разрешения порядка 20–30 нм. Это стало революцией в визуализации внутриклеточных процессов.
Эти методы базируются либо на управлении состояниями флуорофоров, либо на статистической локализации отдельных молекул. Они позволяют исследовать суборганеллярную архитектуру, молекулярные кластеры на мембранах, наноструктуры цитоскелета и взаимодействия белков в реальном времени.
Оптическая когерентная томография (ОКТ)
ОКТ — неинвазивный метод визуализации с использованием низкокогерентного интерференционного сигнала. Он позволяет получать изображения с высоким разрешением (1–15 мкм) на глубину до 2–3 мм. Применяется для изучения структуры тканей in vivo, особенно в офтальмологии, дерматологии и нейробиологии.
Метод основан на регистрации интерференции между отражённым от исследуемой структуры и опорным световым пучком. Использование спектральной ОКТ позволило значительно повысить чувствительность и скорость получения данных.
Фотонная корреляционная спектроскопия
Фотонная корреляционная спектроскопия (FCS) позволяет определять динамические свойства молекул в растворе — такие как диффузионный коэффициент, агрегатное состояние, взаимодействия. Метод основан на анализе флуктуаций интенсивности флуоресценции в малом объёме, обычно ограниченном фокусом лазера в конфокальной системе.
В биофизике FCS применяется для исследования динамики мембранных белков, транспортных процессов, агрегации и самоорганизации биомакромолекул. Это чувствительная методика, позволяющая работать с очень низкими концентрациями (пикомолярный уровень).
Оптогенетика и фотостимуляция
Оптогенетика использует светочувствительные белки, внедрённые в клетки с помощью генетических методов, для контроля над их электрической активностью. Основной инструмент — каналродопсины, светоуправляемые ионные каналы. С помощью фокусированного света можно активировать или тормозить отдельные нейроны с высокой временной и пространственной точностью.
Метод широко используется для изучения нейронных цепей, поведения животных, механизмов памяти и нейропатологий. Он иллюстрирует потенциал оптических методов не только как аналитических, но и как инструментов функционального вмешательства в биосистемы.
Биофотоника: интеграция методов
Оптические методы в биофизике не существуют изолированно. Современная биофотоника стремится к интеграции данных различных оптических подходов — спектроскопических, изображающих, интерференционных — с биоинформатикой, математическим моделированием и молекулярной биологией. Такой синтез позволяет получать количественную, высокоразрешающую информацию о структуре, функции и динамике биологических объектов в норме и патологии.
Оптические методы обладают рядом существенных преимуществ: неинвазивность, высокая чувствительность, возможность наблюдения in vivo, пространственно-временное разрешение. Они занимают центральное место в арсенале современной биофизики, обеспечивая как фундаментальные открытия, так и клинические приложения.