Фемтосекундные лазеры открывают уникальные возможности для изучения повреждений биомолекул, поскольку длительность импульса сопоставима с характерными временами динамики электронных и атомных систем. Взаимодействие высокоинтенсивного, короткого импульса с молекулами биологического объекта вызывает процессы, которые принципиально отличаются от традиционного термического или фотохимического воздействия.
Нелинейные эффекты поглощения: При интенсивности, характерной для фемтосекундных импульсов, вероятность многоквантового поглощения фотонов возрастает многократно. Это приводит к возбуждению электронов в валентной оболочке до высокоэнергетических состояний, формированию возбужденных состояний ионизации и генерации свободных радикалов. Молекулы ДНК и белков особенно чувствительны к такому воздействию из-за наличия конъюгированных систем π-электронов и лабильных химических связей.
Ионизационные процессы: Ионизация биомолекул в результате многоквантового поглощения приводит к разрыву химических связей на уровне отдельных нуклеотидов, аминокислотных остатков и водородных мостиков. В фемтосекундном диапазоне формирование ионизационных следов происходит быстрее, чем процессы теплообмена, что исключает значительное локальное нагревание и делает повреждения «чисто» электронными.
Фемтохимическая реактивность: В отличие от длинных импульсов, фемтосекундные импульсы запускают реакцию химической модификации молекул до образования термодинамически устойчивых промежуточных продуктов. Например, в ДНК возможна прямая фотодиссоциация пиримидиновых и пуриновых оснований, что приводит к образованию тиминовых димеров и разрыву сахарофосфатного скелета без заметного повышения температуры.
Структурная локальная денатурация: Фемтосекундные импульсы создают квазиперфорационные эффекты в молекулярной спирали ДНК. Локальные возбуждения электронов приводят к временному разрыву водородных связей между основаниями, что формирует участки «размороженной» ДНК. Эти зоны являются уязвимыми к последующим химическим воздействиям.
Образование свободных радикалов: Высокоэнергетические электроны и ионизированные молекулы воды приводят к генерации гидроксильных радикалов. Они могут атаковать сахарофосфатный остов ДНК, вызывая одно- и двухцепочечные разрывы. Время жизни радикалов в фемтосекундном масштабе крайне мало, что позволяет наблюдать их прямое воздействие без значительного вторичного термического эффекта.
Фотохимические повреждения оснований: Электронное возбуждение пиримидиновых оснований ДНК может инициировать специфические фотохимические реакции. Образуются ковалентные связи между соседними основаниями (тиминовые димеры), нарушается пространственная конфигурация спирали, изменяется репликационная способность молекулы.
Разрыв пептидных связей: Интенсивные фемтосекундные импульсы вызывают прямое ионизационное возбуждение пептидных связей, что приводит к их разрыву без значительного локального нагрева. Процесс отличается от термического денатурирования, так как сохраняется структурная целостность соседних участков белка.
Изменение третичной структуры: Электронное возбуждение побочных цепей аминокислот может вызвать локальные конформационные перестройки. Особенно чувствительны серосодержащие остатки (цистеин, метионин), которые могут окисляться с формированием дисульфидных мостиков или их разрушением.
Формирование свободных радикалов: Белки, как и ДНК, подвергаются атаке радикалов, образующихся в результате ионизации растворителя. Радикалы могут инициировать цепные реакции разрушения аминокислотных боковых цепей, приводя к изменению каталитической активности ферментов и стабильности структурных белков.
Фемтосекундные импульсы позволяют изучать динамику повреждений с временным разрешением, недостижимым при традиционных методах. Основные этапы:
Фемтосекундная спектроскопия: Используется для измерения электронного возбуждения и динамики радикалов. Позволяет различить прямые и косвенные механизмы разрушения молекул.
Масс-спектрометрия с лазерной абляцией: Позволяет идентифицировать продукты разрыва молекул, включая одиночные и двойные разрывы ДНК и фрагменты белков.
Флуоресцентные методы: Применяются для визуализации локальных повреждений ДНК и белков. Например, флуоресцентные зонды для распознавания разрывов цепей и окисленных оснований.
Молекулярная динамика и моделирование: Позволяет воспроизвести процессы на атомарном уровне и предсказать пути разрушения при различных параметрах лазерного воздействия.
Эти особенности делают фемтосекундное лазерное воздействие уникальным инструментом для фундаментальных исследований в биофизике, а также перспективным для медицинских и биотехнологических приложений, включая контроль точечных изменений в ДНК, селективное разрушение белковых структур и изучение динамики химических процессов в живых системах.